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NP| 安徽農科院發現植物中SpCas9-NG系統自編輯sgRNA

發布時間:2020-03-13 11:37   來源:安徽省農業科學院-水稻所    閱讀: 次   字體:[大] [中] [小]   保護視力色:       

近日,安徽省農業科學院水稻研究所楊劍波/魏鵬程研究組在國際著名期刊Nature Plants(影響因子13.297)中發表了題為“SpCas9-NG self-targets the sgRNA sequence in plant genome editing”的論文。該研究發現SpCas9重要變體SpCas9-NG在植物基因編輯中產生自編輯效應。

目前廣泛使用的CRISPR基因編輯工具來源于原核生物免疫系統。對CRISPR-Cas系統, PAM (protospacer adjacent motif)的捕獲才能啟動Cas復合體的靶向切割活性,因此Cas-PAM識別對區分自身基因組和入侵外源序列至關重要。但是對于CRISPR基因編輯工具,PAM限制了工具的可識別范圍,常常影響了基因組編輯能力(廣泛使用的SpCas9需要靶點附近有NGG PAM才能發揮作用)。通過改造Cas蛋白結構,進化可擴大識別范圍的變體是提高編輯工具靶向能力的主要手段。例如, 開發SpCas9的多種變體SpCas9-VQR、SpCas9-VRER、 xCas9等,顯著擴展了編輯范圍。2018年報道的一個SpCas9變體, SpCas9-NG (R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R) 可將NGG PAM擴寬至NG PAM, 并對NGT, NGG和NGA PAM仍保持較高活性,有效地緩解PAM限制性問題(Nishimasu et al., 2018)。在植物中,已有多個獨立報道利用SpCas9-NG構建基因組編輯和堿基編輯工具,實現了基因組中SpCas9工具無法工作位點的有效編輯(Endo et al., 2019; Ge et al., 2019; Hua et al., 2019; Ren et al., 2019; Zhong et al., 2019)。

圖1,SpCas9-NG在水稻中自編輯PDS-1 sgRNA

然而,研究者在構建作物SpCas9-NG工具的過程中意外發現, 相關農桿菌介導轉化植株T-DNA中sgRNA序列-3位左右普遍存在高頻小片段缺失現象(圖1),暗示著SpCas9-NG可能導致自體靶向編輯。轉化群體中T-DNA突變頻率(自編輯)顯著高于或與目標基因組突變(on-target)頻率相似, 表明SpCas9-NG具有較強自編輯活性。自體靶向不僅存在于以GTTTC起始的esgRNA scaffold結構中,同樣也出現在于以GTTTT起始的native sgRNA scaffold結構中, 而在作為對照的野生型SpCas9和xCas9-3.7系統中,沒有觀察到類似自身靶向效應; 進一步作者還發現以SpCas9-NG構建的堿基編輯工具也存在同樣的sgRNA序列自編輯問題。這些結果表明農桿菌介導的植物SpCas9-NG基因編輯系統廣泛存在著自體靶向編輯效應。 進一步研究發現,sgRNA自編輯產生的突變sgRNA(堿基缺失)仍具有靶向能力,會導致意外的脫靶事件。此外,作者還發現自編輯效應可能是由于SpCas9-NG在基因組中對NTN等非典型序列的識別等原因造成。 而通過使用以GCCCC 為起始的sgRNA scaffold結構可有效的降低SpCas9-NG的自編輯效應。該研究將促進SpCas9-NG 系統在植物中的合理利用,也將為進一步的編輯工具改良和驗證工作提供參考。


安徽省作物遺傳育種重點實驗室楊劍波研究員和魏鵬程研究員為論文共同通訊作者。相關研究在轉基因專項和國家自然科學基金區域創新發展聯合基金資助下完成。

Reference:


ADDIN EN.REFLISTEndo, M., Mikami, M., Endo, A., Kaya, H., Itoh, T., Nishimasu, H., Nureki, O., and Toki, S. (2019). Genome editing in plants by engineered CRISPR–Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants 5:14-17.

Ge, Z., Zheng, L., Zhao, Y., Jiang, J., Zhang, E.J., Liu, T., Gu, H., and Qu, L.-J. (2019). Engineered xCas9 and SpCas9-NG variants broaden PAM recognition sites to generate mutations in Arabidopsis plants. Plant Biotechnology Journal 17:1865–1867.

Hua, K., Tao, X., Han, P., Wang, R., and Zhu, J.-K. (2019). Genome engineering in rice using Cas9 variants that recognize NG PAM sequences. Molecular Plant 12:1003-1014.

Nishimasu, H., Shi, X., Ishiguro, S., Gao, L., Hirano, S., Okazaki, S., Noda, T., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Mori, H., et al. (2018). Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361:1259-1262.

Ren, B., Liu, L., Li, S., Kuang, Y., Wang, J., Zhang, D., Zhou, X., Lin, H., and Zhou, H. (2019). Cas9-NG Greatly Expands the Targeting Scope of the Genome-Editing Toolkit by Recognizing NG and Other Atypical PAMs in Rice. Molecular Plant 12:1015-1026.

Zhong, Z., Sretenovic, S., Ren, Q., Yang, L., Bao, Y., Qi, C., Yuan, M., He, Y., Liu, S., and Liu, X. (2019). Improving plant genome editing with high-fidelity xCas9 and non-canonical PAM-targeting Cas9-NG. Molecular Plant 12:1027-1036.



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